本发明公开了一种普氏野马微卫星位点组合及其引物和应用,属于DNA分子标记技术领域。该普氏野马微卫星位点组合包括16个微卫星位点,所述16个微卫星位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33‑48所示。本发明使用生物信息学方法,筛选普氏野马参考基因组含有微卫星的DNA序列,设计特异性引物,对这些微卫星位点进行了多态性检测,开发了一组具有丰富多态性的普氏野马微卫星分子标记,并提供了一组普氏野马微卫星引物本发明提供的普氏野马微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增,且具有高度多态性,可以应用于普氏野马遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系等研究领域。